Обычно анализируемый образец состоит не из одного вещества, а из смеси веществ. Одни из них представляют интерес для исследователя, другие являются примесями, осложняющими анализ. И хотя существуют аналитические методики, позволяющие проводить анализ сложных смесей, всегда легче работать с чистым веществом. Для получения чистых веществ используют разнообразные методы разделения: перегонку, возгонку, экстракцию, диализ, осаждение, комплексообразование. Здесь мы остановимся на хроматографических методах, широко применяющихся как для разделения веществ, так и для их идентификации и количественного определения.

Хроматографическое разделение основывается на различии таких свойств веществ, как летучесть, полярность, размер молекул, заряд и т.д. От них зависит распределение веществ между подвижной и неподвижной фазами, которые присутствуют в каждой хроматографической методике.

Если подвижная фаза - газ, то метод называется газовой хроматографией (ГХ), если жидкость - жидкостной (ЖХ); если неподвижная фаза заполняет тонкую трубку или колонку, то это колоночная хроматография, а если она нанесена на пластину, то тонкослойная (ТСХ). Принципы разделения во всех случаях одинаковы, различаются только приборная реализация и методика. В тонкослойной хроматографии (рис. 12), например, образец наносят вблизи края пластинки с неподвижной фазой и погружают этот край в растворитель так, чтобы последний не доходил до места нанесения образца. Разделение проводят до тех пор, пока растворитель не дойдет до противоположного конца пластинки. Поскольку определяемые вещества движутся медленнее чистого растворителя, все они остаются на пластинке, но находятся на разном расстоянии от места нанесения образца. Скорость движения вещества характеризуется относительной разностью хода Rf :

В колоночной хроматографии (рис. 13) подвижная фаза непрерывно движется через неподвижную. Смесь, содержащую определяемые вещества, вводят с подвижной фазой в верхнюю часть колонки. Определяемые вещества вымываются из колонки потоком растворителя и проходят через детектор, который определяет их концентрацию. Скорость вымывания характеризуется параметром tr - временем, за которое концентрация вещества на выходе из колонки достигает максимума. Площадь пика на получающейся хроматограмме соответствует количеству вышедшего из колонки вещества.

Механизмы хроматографического разделения. Рассмотрим основные механизмы распределения веществ между подвижной и неподвижной фазами на примере колоночной хроматографии.

Адсорбционная хроматография. Неподвижная фаза представляет собой твердое вещество, на активных центрах которого адсорбируются молекулы определяемых веществ. Разделение может быть основано на различиях их полярностей: чем полярнее вещество, тем сильнее оно адсорбируется на неподвижной фазе и дольше задерживается на ней.

Распределительная хроматография. Неподвижная фаза представляет собой текучее вещество, нанесенное на твердый носитель или химически связанное с ним. Компоненты смеси, пропускаемой через колонку, разделяются вследствие разной растворимости в неподвижной фазе. Как в газовой, так и в жидкостной распределительной хроматографии используют неподвижные фазы с разной полярностью и другими химическими свойствами, от которых зависит растворимость определяемых веществ. Одна из разновидностей распределительной хроматографии - газожидкостная хроматография (ГЖХ) с жидкой неподвижной фазой и газовой подвижной. На рис. 14 представлена газожидкостная хроматограмма лимонного масла.

Вытеснительная хроматография. Неподвижная фаза представляет собой твердое пористое вещество. Крупные молекулы разделяемой смеси не проникают в поры и, не задерживаясь в неподвижной фазе, увлекаются растворителем. Молекулы среднего размера застревают в некоторых порах и на какое-то время остаются в неподвижной фазе, а мелкие молекулы проникают во все поры и перемещаются очень медленно. Так происходит разделение молекул по размерам, а следовательно, по молекулярной массе. Методом вытеснительной хроматографии можно разделять вещества с мол. массой от 100 до 100 000 000.

Ионообменная хроматография. Неподвижной фазой является ионит - твердое, практически нерастворимое в воде и органических растворителях вещество, содержащее ионогенные функциональные группы, способные обменивать свои ионы на ионы, присутствующие в подвижной фазе. Для разделения анионов (органических кислот, аминокислот или хлорид-, нитрат-, сульфат-ионов) используются аниониты, содержащие аминогруппу или четвертичный аммоний. В состав катионитов, применяемых для разделения катионов (аминокислот или ионов металлов), входят карбоновые или сульфокислоты.

Разделение оптически активных веществ. Многие оптически активные (хиральные) соединения (например, биологические молекулы, лекарственные вещества) обладают весьма ценными свойствами, но эти свойства часто бывают присущи только одному из изомеров. Разделить энантиомеры (зеркальные изомеры) при помощи традиционных хроматографических методов не удается, поскольку они обладают идентичными физическими и химическими свойствами, если не считать способности по-разному вращать плоскость поляризации света и взаимодействовать с другими хиральными соединениями. Последнее свойство и лежит в основе методов разделения энантиомеров. Один из подходов состоит в том, что проводят реакцию между смесью оптически активных определяемых веществ и каким-либо хиральным реагентом. Образующиеся продукты обладают разными физическими свойствами, и их разделяют обычными хроматографическими методами. В другом, более распространенном случае хиральное вещество используют в качестве неподвижной фазы для колоночной ЖХ. Энантиомеры по-разному взаимодействуют с ним и разделяются.

Тонкослойная хроматография (ТСХ). Неподвижная фаза - мелкодисперсный сорбент (обычно силикагель), нанесенный на стеклянную или металлическую пластину. На слой сорбента пипеткой наносят анализируемую смесь и пластину ставят торцом в растворитель. Под действием капиллярных сил растворитель поднимается по пластине, и смесь разделяется на компоненты. Флуоресцирующие вещества выявляют в УФ-свете, все остальные - с помощью специфических реагентов. ТСХ - простой, нетрудоемкий метод. На одной пластинке можно одновременно разделять несколько смесей, а для повышения эффективности проводить двумерную хроматографию.